Thèse Année : 2023

Study of iron-sulfur cluster biogenesis in environmental and metabolic stress conditions

Étude de la biogenèse des centres fer-soufre en conditions de stress métaboliques et environnementaux

Résumé

Iron-sulfur (Fe-S) clusters are essential metal cofactors in most living organisms. In Escherichia coli, Fe-S clusters are involved in the activity of more than 150 proteins while in humans, dysfunctions in Fe-S cluster homeostasis are the root of many pathologies. Fe-S cluster proteins are involved in major processes including respiration, central metabolism, DNA replication and repair. My thesis project focused on the relationship between Fe-S cluster metabolism and fatty acid metabolism, as well as on the characterization of an Fe-S cluster regulator. In E.coli, Fe-S cluster biosynthesis is catalyzed by the activity of multi-protein complexes, ISC under optimal conditions, and SUF under stress conditions (oxidative stress, low iron bioavailability). The ISC system is conserved in both prokaryotes and eukaryotes. IscS and its eukaryotic homologue, NFS1, are cysteine desulfurases that supply sulfur from L-cysteine to the ISC machinery. Recent structural and functional data in eukaryotic models have shown an unexpected association between ACP (Acyl Carrier Protein) and NFS1, establishing a link between Fe-S cluster biogenesis and fatty acid biosynthesis (Boniecki et al. 2016). However, this interaction involves one of the few proteins, Isd11, that is not conserved between eukaryotic and prokaryotic ISC machineries. My project was therefore to test the existence of a link between Fe-S cluster biogenesis and fatty acid biogenesis in prokaryotes by studying E. coli as a model. ACP is an essential protein, in order to study its effect on the biogenesis of Fe-S clusters we developed a strategy to decrease its level in the cell by using CRISPRi. By studying the activity of Fe-S cluster regulators and enzymes, we were able to show a positive effect of ACP on the biogenesis of Fe-S clusters. We also showed, by a two-hybrid approach, that ACP interacts specifically with IscS as well as two other proteins of the ISC system, Fdx and HscB. YeiL is an Fe-S cluster regulator whose function is still unknown. It has been described as a regulator carrying a 4Fe-4S cluster (Anjum et al. 2000). The structure of YeiL predicted by Alphafold suggests that among the 5 cysteines of YeiL 4 could be involved in cluster coordination (C68-91-93-116). In order to identify the YeiL regulon we adopted a transcriptomic approach by overproducing YeiL or a variant, YeiL*, whose cysteines potentially involved in binding to the Fe-S cluster were replaced by alanine residues to mimic the apo form of the regulator. The production of YeiL and YeiL* modifies the expression of hundreds of genes, but it appears that the apo form, not binding the Fe-S cluster, is the active form of the regulator. The ontological analysis revealed that sugar metabolism and especially aldaric acid metabolism as well as the response to nitrosative stress (NO) are the most regulated functions. The link between YeiL and the NO stress response was explored by studying the expression of a NO stress response gene, hcp. We were able to demonstrate an interference between the transcriptional regulators controlling the expression of this gene, in particular OxyR and YeiL. The study of the regulatory pathway of the aldaric acid metabolism genes allowed us to show that YeiL interferes with the dedicated activation pathway, via the CdaR regulator. The metabolism of aldaric acids has an important impact during infection. Indeed, these acids result from the oxidation of aldoses by NO, an effector of the innate immune response. The ability to metabolize aldaric acids gives bacteria a selective advantage during gut colonization (Faber et al. 2016). Using a gut colonization model we were able to show that the YeiL regulator has a positive effect on long-term colonization.
Les centres fer-soufre (Fe-S) sont des cofacteurs métalliques essentiels dans la plupart des systèmes vivants. Chez Escherichia coli, les centres Fe-S sont impliqués dans l'activité de plus de 150 protéines tandis que chez l'Homme, des dysfonctionnements dans l'homéostasie des centres Fe-S sont à la base de nombreuses pathologies. Les protéines à centres Fe-S participent à des processus majeurs incluant la respiration, le métabolisme central, la réplication et la réparation de l'ADN. Mon projet de thèse s'est focalisé sur la relation entre le métabolisme des centres Fe-S et celui des acides gras, ainsi que sur la caractérisation d'un régulateur à centre Fe-S. Chez E.coli, la biosynthèse des centres Fe-S est catalysée par l'activité de complexes multi-protéiques, ISC en conditions optimales, et SUF en conditions de stress (stress oxydant, faible biodisponibilité en fer). Une interaction inattendue entre une protéine de la biogénèse des acides gras, ACP (Acyl carrier Protein) et IscS a été reporté par le passé (Gully et al. 2003). Mon projet a donc été de tester l'existence d'un lien entre la biogénèse des centres Fe-S et celle des acides gras chez les procaryotes en étudiant E. coli comme modèle. L'ACP est une protéine essentielle, afin d'étudier son effet sur la biogénèse des centres Fe-S nous avons développé une stratégie visant à diminuer son niveau dans la cellule par l'utilisation de CRISPRi. Par l'étude de l'activité de régulateurs et d'enzyme à centre Fe-S, nous avons pu montrer un effet positif de l'ACP sur la biogenèse des centres Fe-S. Nous avons également montré, par une approche de double hybride, que l'ACP interagit spécifiquement avec IscS ainsi que deux autres protéines du système ISC, Fdx et HscB. YeiL est un régulateur à centre Fe-S dont la fonction est encore inconnue. Il a été décrit comme étant un régulateur portant un centre 4Fe-4S (Anjum et al. 2000). La structure de YeiL prédite par Alphafold suggère que parmi les 5 cystéines de YeiL 4 pourraient être impliquées dans la coordination du cluster (C68-91-93-116). Dans le but d'identifier le régulon de YeiL nous avons adopté une approche transcriptomique en surproduisant YeiL ou d'un variant, YeiL*, dont les cystéines potentiellement impliquées dans la liaison au centre Fe-S ont été remplacées par des résidus alanine afin de mimer la forme apo du régulateur. La production de YeiL et de YeiL* modifie l'expression de centaines de gènes, néanmoins il apparait que la forme apo, donc non liée au centre Fe-S, soit la forme active du régulateur. L'analyse ontologique a révélé que le métabolisme des sucres et notamment celui des acides aldariques ainsi que la réponse au stress nitrosatif (NO) sont les fonctions les plus régulées. Le lien entre YeiL et la réponse au stress NO a été exploré en étudiant l'expression d'un gène répondant au stress NO, hcp. Nous avons ainsi pu mettre en évidence une interférence entre les régulateurs transcriptionnels contrôlant l'expression de ce gène, en particulier OxyR et yeiL. L'étude de la voie de régulation des gènes du métabolisme des acides aldariques nous a permis de montrer que YeiL interfère avec la voie d'activation dédiée, via le régulateur CdaR. Le métabolisme des acides aldariques a un impact important au cours de l'infection. En effet, ces acides résultent de l'oxydation d'aldoses par le NO, un effecteur de la réponse immunitaire innée. La capacité à métaboliser les acides aldariques confèrent aux bactéries un avantage sélectif lors de la colonisation de l'intestin (Faber et al. 2016). En utilisant un modèle de colonisation de l'intestin nous avons pu montrer que le régulateur YeiL a un effet positif sur la colonisation à long terme.
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Origine Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

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Identifiants

  • HAL Id : tel-04914252 , version 1

Citer

Soufyan Fakroun. Study of iron-sulfur cluster biogenesis in environmental and metabolic stress conditions. Microbiology and Parasitology. Université Paris Cité, 2023. English. ⟨NNT : 2023UNIP5059⟩. ⟨tel-04914252⟩
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